从原理上来讲，3D光片显微技术与传统的宽场显微技术或共聚焦显微技术有很大不同，后两者需要照射或扫描成像目标物中的整个样本，而光片显微镜只需要用薄层光（实际上为2D）从侧边照射样本。随后从样本的上部或下部检测所产生的荧光信号，检测方向与薄层光线的照射方向相垂直。因此，该技术的光学层析能力（optical sectioning，即层面上样本结构的分辨能力）不像共聚焦成像技术那样取决于焦点处光子的采集，而是来自于在开始时每次仅激发一个层面上的荧光基团。换言之，光片显微技术只会激发一个焦平面上或旁边的分子，因此降低了光毒性，并且提高了长时间对活体样本进行成像的能力。基于3D光片荧光显微镜本身的技术特点，该系统满足了快速、大体积3D成像、低光毒性及长时间成像的需要。